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蛋白磷酸化指蛋白質肽鏈上特定氨基酸共價結合磷酸基團的過程，結合磷酸基團的氨基酸的種類以及其處于多肽鏈中的位置就稱為磷酸化位點。真核生物的磷酸化主要發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基上，而原核生物磷酸化主要發生在組氨酸、精氨酸和賴氨酸等殘基上。

利用液相色譜串聯質譜技術LC-MS-MS鑒定磷酸化位點需要先鑒定發生磷酸化的肽段，在此基礎上進行磷酸化位點分析。基于LC-MS-MS的磷酸化位點鑒定中，利用蛋白酶將蛋白質樣品消化成小片段肽段，由于正常生理條件下磷酸化水平較低，磷酸化肽段豐度也較低，為了提高實驗的靈敏度和準確性，通常需要對磷酸化的肽段進行富集再進行液相色譜串聯質譜分析。串聯質譜會測量完整的肽質量和碎片離子質量，通過分析肽段分子質量是否增加了磷酸酯基團的質量數來判定該肽段磷酸化與否。在某些情況下檢測到的磷酸化肽段只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，那么這個氨基酸位點即是磷酸化位點，當檢測到的磷酸化肽段含有多個氨基酸殘基時，則需要進行二級質譜確定磷酸化的氨基酸位點。

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